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    了解一下活性氧檢測試劑盒的操作過程吧

    更新時間:2021-04-02  |  點擊率:1150
      活性氧檢測試劑盒是一種基于熒光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的熒光強度變化,定量檢測細胞內活性氧水平的常用方法。
     
      下面讓我們來了解一下活性氧檢測試劑盒的操作過程吧
     
      一、裝載探針
     
      1、原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)
     
      1)細胞準備:檢測前一天進行細胞鋪板,確保檢測時細胞匯合度達到50~70%。
     
      注:必須保證細胞狀態健康,且檢測時不會過度生長。
     
      2) 藥物誘導:去除細胞培養液,加入適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物,于37℃細胞培養箱內避光孵育,具體誘導時間根據藥物本身特性,以及細胞類型來決定。
     
      陽性對照:先用無血清培養基等稀釋陽性對照(Rosup, 100 mM)到常用工作濃度100 μM,加入細胞,一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高,但依細胞類型會有比較明顯差異。(如,HeLa細胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h;)
     
      3)探針準備:探針裝載前按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μM。
     
      4) 探針裝載:吸除誘導用藥物,加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜。例如;對于6孔板通常不少于1000 μL,對于96孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養箱內避光孵育30 min。
     
      5) 細胞清洗:用無血清培養液洗滌細胞1~2次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。
     
      2、收集細胞后裝載探針:適用于貼壁細胞和懸浮細胞。
     
      1) 細胞準備:按照標準方法培養細胞,必須保證檢測用細胞狀態健康。按照適當方法,清洗并收集足量的細胞。
     
      2)藥物誘導:將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物,于37℃細胞培養箱內避光孵育,具體誘導時間根據藥物本身特性,以及細胞類型來決定。(可選)陽性對照:先用無血清培養基等稀釋陽性對照(Rosup, 100 mM)到常用工作濃度100 μM,加入細胞,一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高,但依細胞類型會有比較明顯差異。【如,HeLa細胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h;】
     
      3) 探針準備:探針裝載前,按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μM。
     
      4) 探針裝載:去除細胞內藥物,離心收集細胞,加入適當稀釋好的探針,使其細胞密度為1.0×106~2.0×107。
     
      注:細胞密度需根據后續的檢測體系,檢測方法,以及檢測總量來進行調整。如,對于流式分析,單管檢測內細胞數目不少于104,也不可多于106。每隔3-5 min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。
     
      5)細胞清洗:用無血清細胞培養液洗滌細胞1~2次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。
     
      二、檢測
     
      原位裝載探針法:激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。
     
      收集細胞后裝載探針:用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測,也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
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